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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷硝化作用遮盖组学、LC-MS/MS磷硝化作用位点了解技术服务。
日文版头：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
中文名网站标题：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
顾客政府部门：山东大学
分析建筑材料：拟南芥侧根
拜谱给予技术设备：磷硝化作用体现组学、LC-MS/MS磷硝化作用位点概述
研发难点：
PART 01 研究方案没想到
01、生长的素可以淡化VIK的磷碱化下列关于转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷酸性反应淀粉酶质酚类化合物析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 发芽素加速VIK的磷酸性反应以及其转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷硝化作用实验设计。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过发酵粉双混种杂交研究分析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶互补式影像实验性（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且身体外磷碱化实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。实时监控降钙素原检测PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素信息更好地政策调控 LR 发育期
使用浅析两位VIK T-DNA加入突然变化体（vik-2和vik-3），找到与原生态型相比之下，突然变化体的LR比热容计算、LR原基（LRP）和已健康胸部阴茎发育状况的LR取得减小，更是要格外重视是vik-2（图2）。相反的，过呈现VIK的转遗传染色体茎秆的表现出LR比热容计算增多。除此之外，在vik-2突然变化体题材下呈现VIK的转遗传染色体茎秆恢复原状了LR健康胸部阴茎发育状况一些缺陷。萌发素处理试验说明，vik-2突然变化体对萌发素诱惑的LR健康胸部阴茎发育状况反响减退，说明VIK在萌发素宏观调控LR健康胸部阴茎发育状况中引领主要使用。 
图2 VIK介导的发芽素卫星信号信号通路同向政策调控LR的成长发育
03、VIK 与ERF13 通过数学沟通互动
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双团伙荧光相互依存 （BiFC）和免疫力共水解实验性（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13互为功能
04、VIK以双面馈的方案国家宏观调控ERF13磷硝化作用
通过磷过酸核蛋白组学定量分析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点变异遇到显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以正反面馈措施磷硝化作用ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷过酸推进ERF13吸附
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过身体检测和体里检测，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模拟机和磷酸降解突变率体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚组织标记进行分析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷过酸降速了ERF13可降解
06、VIK 介导的 ERF13 磷过酸调高 LR 的展现
深入分析进每一步初探了VIK政策调控的ERF13可溶解在侧根（LR）發育中的功能。经过相对较各不相同转人类基因仿真草本动绿植的系的LR表型，出显 过表述ERF13可压制了LR的出显，在vik进化体中这个可压制功能削弱，而在过表述YFP-VIK的时代背景下这个可压制功能削弱（图6）。最后，相对较ERF13的各不相同磷碱化养成和磷酸灭活进化体的过表述仿真草本动绿植的系，出显 ERF132A-Myc（磷酸灭活）的仿真草本动绿植的系LR出显越来越少，而ERF132D-Myc（磷碱化养成）的仿真草本动绿植的系LR出显略多。这类报告单证实，VIK介导的ERF13磷碱化和可溶解有利于促进了LR的出显。 
图6 VIK介导的ERF13磷硝化作用力促LR的出現
07、VIK在侧根发肓中磷硝化作用并安稳LBD18蛋白质
能够深入分析3个VIK T-DNA加入变化体（vik-2和vik-3），出现 与野外型比起，变化体的侧根（LR）高导热系数、LR原基（LRP）和已发肓的LR差异性抑制，非常是vik-2（图7）。反过来，过展示VIK的转遗传表观遗传茎叶行为出LR高导热系数增多。不仅而且，在vik-2变化体后台下展示VIK的转遗传表观遗传茎叶恢愎了LR发肓一些缺陷。滋生素治疗进行实验证实，vik-2变化体对滋生素诱发的LR发肓反映弱化，证实VIK在滋生素调节的功效LR发肓中发挥出重中之重的功效。 
图7 VIK 在LR出现工作中简单磷过酸和稳固LBD18球蛋白
PART 02 内容总结ppt
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷硝化作用血清质组学阐述筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的发展素4g信号可以调节侧根形成了
PART 03 拜谱总结ppt
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的核核蛋白含量组学、绘制核核蛋白含量组学、基础代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—超多程度DIA·磷酸性反应突显组，采用创新含有技术性+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现哺乳动物范本10w+、值物范本5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
可以参考论文：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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